試劑

 

包被液（P H9.6碳酸鹽緩沖液） 稱取碳酸鈉0.32g、碳酸氫鈉0 .5 8 6 g ,置200ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度。

 

磷酸鹽緩沖液（p H 7 . 4 )稱取氯化鈉8g、氯化鉀0.2g、磷酸氫二鈉1.44g、磷酸二氫鉀0.24g，加水溶解并稀釋至500ml, 121°C滅菌15分鐘。

 

洗滌液（pH7.4) 量取聚山梨酯20 0.5ml，加磷酸鹽緩沖液至500ml。

 

稀釋液（p H 7 . 4 )稱取牛血清白蛋白0.5g，加洗滌液溶解并稀釋至100ml。

 

濃稀釋液稱取牛血清白蛋白l.O g , 加洗滌液溶解并稀釋至100ml。

 

底物緩沖液（pH 5 .0枸櫞酸-磷酸鹽緩沖液） 稱取磷酸氫二鈉（Na2HP04 . 12H20 )1 . 84g、枸櫞酸 0. 51g，加水溶解并稀釋至100ml。

 

底物液取鄰苯二胺8mg、30%過氧化氫30^1，溶于底物緩沖液20ml中。臨用時現(xiàn)配。

 

終止液lm o l/L硫酸溶液。標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備按菌體蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品說明書加水復(fù)溶，精密量取適量，用稀釋液稀釋成每lm l中含菌體蛋白質(zhì)500ng、250ng、125ng、62. 5ng、31. 25ng、15. 625ng, 7. 8125ng的溶液。

 

供試品溶液的制備

 

取供試品適量，用稀釋液稀釋成每lml中約含250μg的溶液。如供試品每lml中含量小于500μg時，用濃稀釋液稀釋1倍。

 

測定法

 

取兔抗大腸桿菌菌體蛋白質(zhì)抗體適量，用包被液溶解并稀釋成每lml中含10μg的溶液，以100μl/孔加至9 6孔酶標(biāo)板內(nèi)，4放置過夜（16?18小時）。用洗滌液洗板3次；用洗滌液制備1%牛血清白蛋白溶液，以200μl/孔加至酶標(biāo)板內(nèi)，37放置2 小時；將封閉好的酶標(biāo)板用洗滌液洗板3 次；以100μl/孔加人標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液，每個稀釋度做雙孔，同時加入2 孔空白對照（稀釋液），37°C放置2 小時；用稀釋液稀釋辣根過氧化物酶（HRP)標(biāo)記的兔抗大腸桿菌菌體蛋白質(zhì)抗體1000倍，以100μl/ 孔加至酶標(biāo)板內(nèi)，37°C放置1 小時，用洗滌液洗板1 0次，以lOOμl/孔加人底物液，3 7 避光放置4 0 分鐘，以5 0 μl/孔加入終止液終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀在波長4 9 2 n m 處測定吸光度，應(yīng)用計算機分析軟件進行讀數(shù)和數(shù)據(jù)分析，也可使用手工作圖法計算。

 

以標(biāo)準(zhǔn)品溶液吸光度對其相應(yīng)的濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并以供試品溶液吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上得到相應(yīng)菌體蛋白質(zhì)含量，

 

按以下公式計算：

 

供試品菌體蛋白質(zhì)殘留量（％) = （c×n）/（T×106）×100

 

式中  c為供試品溶液中菌體蛋白質(zhì)含量，ng/ml;

 

      n為供試品稀釋倍數(shù)；

 

      T為供試品蛋白質(zhì)含量，mg/ml。

 

注：也可采用經(jīng)驗證的酶聯(lián)免疫試劑盒進行測定。