微生物數(shù)量的測(cè)定
細(xì)菌群體生長表現(xiàn)為細(xì)胞數(shù)目的增加或細(xì)胞物質(zhì)的增加。測(cè)定細(xì)胞數(shù)目的方法有
顯微鏡直接計(jì)數(shù)法(direct microscopic count)、平板菌落計(jì)數(shù)法(plate count)、光電比油法(turbidity estimation by spectrophotometer)、最大或然數(shù)法(most probable number MPN)以及膜
過濾法(membrane filtration)等。
測(cè)定細(xì)胞物質(zhì)的方法有細(xì)胞干重的測(cè)定，細(xì)胞某種成分如氮的含量、RNA和
DNA的含量測(cè)定，代謝產(chǎn)物的測(cè)定等?？傊?，測(cè)定微生物生長量的方法很多，各有優(yōu)缺點(diǎn)，工作中應(yīng)根據(jù)具體情況要求加以選擇。
本實(shí)驗(yàn)主要介紹生產(chǎn)、科研工作中比較常用的顯微鏡直接計(jì)數(shù)法、平板菌落計(jì)數(shù)法和光電比濁計(jì)數(shù)法。
一 顯微鏡直接計(jì)數(shù)法
（一）目的要求
2．掌握使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)的方法。
（二） 基本原理
顯微鏡直接計(jì)數(shù)法是將小量待測(cè)樣品的懸浮液置于一種特別的具有確定面積和容積的載玻片上(又稱計(jì)菌器)，于顯微鏡下直接計(jì)數(shù)的一種簡便、快速、直觀的方法。目前國內(nèi)外常用的計(jì)菌器有：血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、Peteroff-Hauser計(jì)菌器以及Hawksley計(jì)菌器等，它們都可用于
酵母、細(xì)菌、霉菌孢子等懸液的計(jì)數(shù)，基本原理相同。
后兩種計(jì)菌器由于蓋上蓋玻片后，總?cè)莘e為0.02mm3，而且蓋玻片和載波片之間的距離只有0.02mm，因此可用油浸物鏡對(duì)細(xì)菌等較小的細(xì)胞進(jìn)行觀察和計(jì)數(shù)。除了用這些計(jì)菌器外，還有在顯微鏡下直接觀察涂片面積與視野面積之比的估算法，此法一般用于牛乳的細(xì)菌學(xué)檢查。顯微鏡直接計(jì)數(shù)法的優(yōu)點(diǎn)是直觀、快速、操作簡單。但此法的缺點(diǎn)是所測(cè)得的結(jié)果通常是死菌體和活菌體的總和。目前已有一些方法可以克服這一缺點(diǎn)，如結(jié)合活菌染色微室
培養(yǎng)（短時(shí)間）以及加細(xì)胞分裂抑制劑等方法來達(dá)到只計(jì)數(shù)活菌體的目的。本實(shí)驗(yàn)以血球計(jì)數(shù)板為例進(jìn)行顯微鏡直接計(jì)數(shù)。另外兩種計(jì)菌器的使用方法可參看各廠商的說明書。
用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)是一種常用的微生物計(jì)數(shù)方法。該計(jì)數(shù)板是一塊特制的載玻片，其上由四條槽構(gòu)成三個(gè)平臺(tái)；中間較寬的平臺(tái)又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺(tái)上各列有一個(gè)方格網(wǎng)，每個(gè)方格網(wǎng)共分為九個(gè)大方格，中間的大方格即為計(jì)數(shù)室。計(jì)數(shù)室的刻度一般有兩種規(guī)格，一種是一個(gè)大方格分成25個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成16個(gè)小方格；另一種是一個(gè)大方格分成16個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成25個(gè)小方格，但無論是哪一種規(guī)格的計(jì)數(shù)板，每一個(gè)大方格中的小方格都是400個(gè)。每一個(gè)大方格邊長為lmm，則每一個(gè)大方格的面積為lmm2，蓋上蓋玻片后，蓋玻片與載玻片之間的高度為0.lmm，所以計(jì)數(shù)室的容積為0.lmm3(萬分之一毫升)
計(jì)數(shù)時(shí)，通常數(shù)五個(gè)中方格的總菌數(shù)，然后求得每個(gè)中方格的平均值，再乘上25或16，就得出一個(gè)大方格中的總菌數(shù)，然后再換算成lmL菌液中的總菌數(shù)。
設(shè)五個(gè)中方格中的總菌數(shù)為A，菌液稀釋倍數(shù)為B，如果是25個(gè)中方格的計(jì)數(shù)板，則
1mL菌液中的總菌數(shù)=A/5×25×104×B=50000A•B（個(gè)）
同理，如果是16個(gè)中方格的計(jì)數(shù)板，則
1mL菌液中的總菌數(shù)=A/5×16×104×B=32000A•B（個(gè)）
（三）器材
1．菌種 釀酒酵母
2．儀器或其他用具 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，顯微鏡，蓋玻片，無菌毛細(xì)滴管。
（四）操作步驟
l．菌懸液制備
以無菌生理鹽水將釀酒酵母制成濃度適當(dāng)?shù)木鷳乙?/div>
2．鏡檢計(jì)數(shù)室
在加樣前，先對(duì)計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室進(jìn)行鏡檢。若有污物，則需清洗，吹干后才能進(jìn)行計(jì)數(shù)。
3．加樣品
將清潔
干燥的血細(xì)胞計(jì)數(shù)板蓋上蓋玻片，再用無菌的毛細(xì)滴管將搖勻的釀酒酵母菌懸液由蓋玻片邊緣滴一小滴，讓菌液沿縫隙靠毛細(xì)滲透作用自動(dòng)進(jìn)入計(jì)數(shù)室，一般計(jì)數(shù)室均能充滿菌液。取樣時(shí)先要搖勻菌液；加樣時(shí)計(jì)數(shù)室不可有氣泡產(chǎn)生。
4．顯微鏡計(jì)數(shù)
加樣后靜止5min，然后將血細(xì)胞計(jì)數(shù)板置于顯微鏡載物臺(tái)上，先用低倍鏡找到計(jì)數(shù)室所在位置，然后換成高倍鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)。
調(diào)節(jié)顯微鏡光線的強(qiáng)弱適當(dāng)，對(duì)于用反光鏡采光的顯微鏡還要注意光線不要偏向一邊，否則視野中不易舌清楚計(jì)數(shù)室方格線，或只見豎線或只見橫線。
在計(jì)數(shù)前若發(fā)現(xiàn)菌液太濃或太稀，需重新調(diào)節(jié)稀釋度后再計(jì)數(shù)。一般樣品稀釋度要求每小格內(nèi)約有5~10個(gè)菌體為宜。每個(gè)計(jì)數(shù)室選5個(gè)中格(可選4個(gè)角和中央的一個(gè)中格)中的菌體進(jìn)行計(jì)數(shù)。位于格線上的菌體一般只數(shù)上方和右邊線上的。如遇酵母出芽，芽體大小達(dá)到母細(xì)胞的一半時(shí)，即作為兩個(gè)菌體計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)一個(gè)樣品要從兩個(gè)計(jì)數(shù)室中計(jì)得的平均數(shù)值來計(jì)算樣品的含菌量。
5．清洗血細(xì)胞計(jì)數(shù)板
使用完畢后，將血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在水龍頭用水沖洗干凈，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹風(fēng)機(jī)吹干。鏡檢，觀察每小格內(nèi)是否有殘留菌體或其他沉淀物。若不干凈，則必須重復(fù)洗滌至干凈為止。
